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第 3 课 · 30 分钟

荧光：分子怎样把光还回来

汤力水在紫外灯下发蓝光。雅布隆斯基图告诉你一个被吸收的光子有几条去路；一台虚拟的时间分辨荧光仪测出奎宁的寿命，并用施特恩–福尔默方程看氯离子怎样让它熄灭。

本课目标

  • 在雅布隆斯基图上追踪一个被吸收的光子：振动弛豫、内转换、荧光、系间窜越和磷光
  • 由速率常数算出激发态寿命和荧光量子产率，解释斯托克斯位移
  • 用施特恩–福尔默方程由寿命数据求出猝灭速率常数，并区分动态猝灭与静态猝灭
  • 说明荧光分析为什么灵敏、线性范围在哪里结束，以及哪些物质会干扰测定

把一瓶汤力水放到紫外灯下，它会发出幽幽的蓝光。原因是水里的奎宁：它吸收看不见的紫外光（约 350 nm），几纳秒后放出波长更长的蓝光（约 450 nm）。吸收的光子能量更高，放出的能量更低，差值变成了热——这个红移叫斯托克斯位移。荧光测的是黑暗背景上的一点光，而不是强光中的一点减弱，所以比吸收光度法灵敏得多，是生物化学里标记分子的主力。

先预测

往酸化的奎宁溶液里加一点食盐（NaCl），在紫外灯下看，荧光会怎样？

先选一个答案并锁定，再看模型怎么说。猜错比不猜学得更多。

雅布隆斯基图

吸收一个光子只需约 10⁻¹⁵ s，分子被送到 S₁ 或更高单重态的某个振动能级上。它先在约 10⁻¹² s 内把多余的振动能交给溶剂，落到 S₁ 的最低振动能级——所以荧光总是从同一个能级发出，与激发波长无关（卡莎规则），而且波长比吸收长。接下来几种过程互相竞争：荧光（发出光子）、内转换（能量变成热回到 S₀）、系间窜越（自旋翻转进入三重态 T₁）。T₁ 回到 S₀ 要再翻转一次自旋，是“禁阻”的，所以磷光可以持续毫秒到几秒。

每条通道都是一级过程，谁的速率常数大谁分得多：荧光量子产率就是辐射速率常数占总速率常数的份额，而寿命是总速率常数的倒数。

τ=1kr+kic+kisc,ΦF=kr τ\tau = \frac{1}{k_\text{r} + k_\text{ic} + k_\text{isc}}, \qquad \Phi_\text{F} = k_\text{r}\,\tau
竞争的一级衰变：寿命由所有通道共同决定，产率是某一通道所占的份额。
τ\tau
激发态寿命
krk_\text{r}
辐射（荧光）速率常数
kic,kisck_\text{ic}, k_\text{isc}
内转换与系间窜越的速率常数
ΦF\Phi_\text{F}
荧光量子产率
竞争的一级衰变 · 寿命与量子产率由速率常数算出

雅布隆斯基图：一个光子的去向

S₀S₁T₁吸收 ~10⁻¹⁵ s荧光 0.60内转换 0.40系间窜越 0.00磷光0.000

S₁ 寿命 τ = 20.4 ns；Φ_F = 0.600，Φ_IC = 0.400，Φ_ISC = 0.000；T₁ 寿命 990 μs，磷光产率 Φ_P = 0.000。

每吸收 1000 个光子：600 个荧光光子，0 个磷光光子，其余变成热。

每个激发态都按一级反应衰变，各通道按速率常数的比例分走激发态：Φ_i = k_i τ。奎宁的起点取 τ = 20.4 ns（Gutow 2005，0.5 M H₂SO₄）和 Φ_F = 0.60（0.1 M HClO₄ 中的量子产率标准），两者测于不同的酸中，只作示意；奎宁的暗通道在这里全部算作内转换。时间标度是数量级。
拖动速率常数，看箭头粗细（量子产率）和寿命怎样变化。只把内转换加快十倍，荧光产率和寿命一起下降——荧光和寿命总是一同变化。换成“系间窜越为主”：几乎所有激发态都进入三重态，磷光寿命以毫秒计。

例题精解

奎宁的辐射速率常数

奎宁的荧光寿命约 20.4 ns，荧光量子产率约 0.60。求辐射速率常数和其他衰变通道的总速率常数。

猝灭与施特恩–福尔默方程

猝灭剂 Q 每与激发态碰撞一次，就可能把它送回基态，这相当于多了一条速率为 kq[Q]k_\text{q}[\text{Q}] 的衰变通道。荧光强度和寿命于是按同样的比例下降，F0/FF_0/F 和 τ0/τ\tau_0/\tau 对 [Q] 都是直线，斜率 KSV=kqτ0K_\text{SV} = k_\text{q}\tau_0。Gutow 用脉冲激光测了奎宁在不同氯离子浓度下的衰减，得到 kq=5.2×109 M−1 s−1k_\text{q} = 5.2\times10^9\ \text{M}^{-1}\,\text{s}^{-1}；按溶液黏度算出的扩散控制极限 8RT/3η8RT/3\eta 是 5.85.8–6.5×1096.5\times10^9，说明几乎每一次碰撞都能猝灭。

另一种可能是静态猝灭：猝灭剂与基态分子结合成不发光的配合物。这时发光的分子变少了，但剩下的分子寿命不变——只测强度分不出两种机理，测寿命就能分出来。

F0F=τ0τ=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]\frac{F_0}{F} = \frac{\tau_0}{\tau} = 1 + k_\text{q}\tau_0[\text{Q}] = 1 + K_\text{SV}[\text{Q}]
动态猝灭的施特恩–福尔默方程。静态猝灭只有 F₀/F 随 [Q] 增大，τ 不变。
F0,FF_0, F
无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度
kqk_\text{q}
双分子猝灭速率常数
KSVK_\text{SV}
施特恩–福尔默常数
337 nm 脉冲激发 · 480 nm 检测 · 按 Gutow（2005）的实验参数计算

时间分辨荧光仪：奎宁与氯离子

荧光衰减
020406080100120140时间 / ns123lg 计数
  • 信号
  • 尾部指数拟合
  • 仪器响应

这一次：τ = 20.6 ns（拟合 420 个点）

稳态荧光 F/F₀ = 1.000

施特恩–福尔默图
00.020.040.06[Cl⁻] / (mol L⁻¹)01002003004001/τ / (10⁶ s⁻¹)
  • 1/τ
  • 扩散控制极限 8RT/3η

至少测两种浓度才能画出直线。

参数取自 Gutow（J. Chem. Educ. 2005）：0.5 M H₂SO₄ 中奎宁的寿命 20.4 ns，氯离子的猝灭常数 5.2 × 10⁹ M⁻¹ s⁻¹，仪器响应约 2.5 ns；扩散控制极限 5.8–6.5 × 10⁹ M⁻¹ s⁻¹ 是他按溶液黏度算出的范围。衰减曲线是单指数与高斯仪器响应的卷积，噪声按计数的平方根、由确定性散列生成；拟合只用峰后 5 ns 起的尾部，和学生手算的做法一样。“假想配合物”一项只为对比而设，氯离子并不这样作用。
对每种氯离子浓度发射一次激光：程序拟合衰减曲线的尾部得到 τ，并把 1/τ 记到施特恩–福尔默图上。测够几个点，斜率就是 kqk_\text{q}——和扩散控制极限（紫色带）比一比。再切换到“假想配合物”：荧光变暗，寿命却纹丝不动。

概念检查

某猝灭剂使一种染料的荧光强度减半，但用时间分辨荧光测得的寿命不变。这是哪种猝灭？

计算练习

奎宁被氯离子猝灭的 KSV=106 M−1K_\text{SV} = 106\ \text{M}^{-1}。多大浓度的氯离子（mM）能使荧光减半？

mM

要点回顾

  • 被吸收的光子先经振动弛豫落到 S₁ 最低能级，再由荧光、内转换或系间窜越竞争地离开；荧光波长比吸收长（斯托克斯位移）。
  • 寿命 τ = 1/Σk，量子产率 Φ_F = k_r τ：任何新增的衰变通道都会同时缩短寿命、降低产率。
  • 动态猝灭时 F₀/F = τ₀/τ = 1 + k_qτ₀[Q]；奎宁被氯离子猝灭的 k_q = 5.2 × 10⁹ M⁻¹ s⁻¹，接近扩散控制极限。静态猝灭只降低强度、不改变寿命。
  • 荧光分析灵敏，但只在低吸光度下线性（内滤效应），且要防范猝灭剂干扰。
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数据与参考文献

  1. J. H. Gutow, “Halide (Cl⁻) quenching of quinine sulfate fluorescence: a time-resolved fluorescence experiment for physical chemistry”, J. Chem. Educ. 82, 302–305 (2005).
  2. A. M. Brouwer, “Standards for photoluminescence quantum yield measurements in solution (IUPAC Technical Report)”, Pure Appl. Chem. 83, 2213–2228 (2011).
  3. K. Nawara & J. Waluk, “Goodbye to quinine in sulfuric acid solutions as a fluorescence quantum yield standard”, Anal. Chem. 91, 5389–5394 (2019).
  4. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. (Springer, 2006), Ch. 1, 8 (Jablonski diagram; quenching).