第 4 课 · 35 分钟

气相色谱与高效液相色谱

柱温、载气、固定相、流动相组成和梯度——在模拟器上把五种溶剂和一组防腐剂分开，再用内标法由峰面积测定血液中的乙醇。

本课目标

画出气相色谱仪与高效液相色谱仪的组成，说明常用检测器的特点
解释柱温、固定相和流动相组成如何改变保留与选择性，并会计算保留指数
说明程序升温和梯度洗脱为什么能解决“一般洗脱问题”
用内标法和响应因子由峰面积计算浓度

一辆车被拦下，司机的呼气读数可疑，于是抽血送检。实验室把 0.5 mL 血样和含 1-丙醇的内标溶液密封在小瓶里加热，抽取瓶子上方的气体注入气相色谱仪。三分钟后，色谱图上出现两个峰：乙醇和 1-丙醇。两个峰的面积之比，决定了这份报告是“饮酒驾车”还是“醉酒驾车”。这一课我们来弄清楚，这张色谱图是怎样得到的，又怎样变成一个可靠的数字。

先预测

在非极性的聚二甲基硅氧烷（OV-101）柱上、80 °C 时，苯和 2-戊酮几乎重叠（Rs ≈ 0.5）。怎样最有效地把它们分开？

先选一个答案并锁定，再看模型怎么说。猜错比不猜学得更多。

把柱子从 30 m 换成 60 m 把柱温从 80 °C 降到 50 °C 换成极性的聚乙二醇（Carbowax）柱提高载气流速

气相色谱：挥发性决定出峰

气相色谱仪由五部分组成：高压钢瓶提供的载气（He、H₂ 或 N₂）；把液体样品瞬间汽化的进样口（分流/不分流，或上面提到的顶空进样）；装在恒温箱里的毛细管柱（内径 0.25 mm、长 15–60 m 的熔融石英管，内壁涂 0.1–5 µm 的聚合物液膜）；检测器；以及记录信号的数据系统。

常用检测器各有所长：氢火焰离子化检测器（FID） 对含 C–H 的有机物响应几乎正比于碳原子数，线性范围达 10⁷，是定量的主力；热导检测器（TCD） 什么都能测但不灵敏；电子捕获检测器（ECD） 对含卤素的农药极其灵敏；质谱（MS） 同时给出结构信息。

气相中溶质的保留首先取决于它的蒸气压：越难挥发，在固定液中待得越久。在非极性柱上，正构烷烃的 lg k 与碳数成直线，出峰顺序大致就是沸点顺序。其他化合物的位置用保留指数 I 表示：把它“插”进前后两个正构烷烃之间，正庚烷为 700、正辛烷为 800。同一化合物在不同固定相上的保留指数之差（McReynolds 常数）刻画了固定相的极性。

I = 100\left[n + \frac{\lg t\prime_{\mathrm{R},x} - \lg t\prime_{\mathrm{R},n}}{\lg t\prime_{\mathrm{R},n+1} - \lg t\prime_{\mathrm{R},n}}\right]

Kováts 保留指数（恒温）。t′_R = t_R − t_M 为调整保留时间，n 是先于 x 流出的正构烷烃的碳数。

$t\prime_\mathrm{R}$: 调整保留时间 t_R − t_M
$n, n+1$: 前后两个正构烷烃的碳数

柱温是气相色谱最有力的旋钮：温度每升高约 20–30 °C，k 大约减半。混合物中既有低沸点又有高沸点组分时，任何恒温都顾此失彼——温度低，前面的峰分得好但后面的峰又宽又晚；温度高，后面的峰出得快但前面的挤成一团。这叫一般洗脱问题。程序升温让柱温随时间线性上升，每个组分都在“适合自己”的温度下被赶出来，结果峰间距均匀、峰宽也相近。

高效液相色谱：流动相也参与竞争

不能汽化或受热会分解的物质——药物、蛋白质、糖、染料——交给高效液相色谱（HPLC）。高压泵以 0.2–2 mL/min 推动流动相通过装满 1.7–5 µm 颗粒的色谱柱（柱压数十到上千 bar），进样阀把几微升样品送入，紫外/二极管阵列、荧光、示差折光或质谱检测器在柱后读出信号。

最常用的是反相色谱：固定相是键合在硅胶上的 C18 长链（非极性），流动相是水与甲醇或乙腈的混合物（极性）。疏水的分子更喜欢 C18，保留更强；流动相中有机溶剂比例 φ 越大，洗脱能力越强。在很宽的范围内 lg k 与 φ 成直线（线性溶剂强度模型），S 值对小分子约为 3–5：甲醇比例增加 10 %，k 大约缩小一半到三分之一。与程序升温对应，液相用梯度洗脱逐渐提高 φ。

\lg k = \lg k_\mathrm{w} - S\,\varphi

线性溶剂强度模型：k_w 是外推到纯水中的保留因子，S 反映分子对有机溶剂的敏感程度。

$\varphi$: 流动相中有机溶剂的体积分数
$k_\mathrm{w}$: φ = 0 时的保留因子（外推值）
$S$: 溶剂强度参数，小分子约 3–5

保留由热力学模型计算 · 峰宽由塔板高度计算

色谱图模拟器

填料粒径

柱长

流速（4.6 mm 柱） · 1.0 mL/min 流动相中甲醇比例 · 60 %

洗脱方式

死时间 t_M: 1.62 min
最后一个峰: 33.21 min
最难分离的一对: Rs = 14.69
塔板数（最后一个峰）: 12200
柱压: 98 bar

全部基线分离

峰	化合物	t_R / min	k（流出时）	N	与前一峰 Rs
1	咖啡因	2.21	0.363	12200	—
2	尼泊金甲酯	5.33	2.29	12200	22.86
3	尼泊金乙酯	9.20	4.68	12200	14.69
4	尼泊金丙酯	17.09	9.55	12200	16.57
5	尼泊金丁酯	33.21	19.5	12200	17.69

液相模式：60 % 甲醇等度洗脱时五个峰都分开了，但尼泊金丁酯要等半个多小时；降到 40 %，它一小时也出不来。提高到 80 %：6 分钟内全部流出，可咖啡因和尼泊金甲酯的 k 不到 0.5，紧贴着死时间——样品基质里不保留的杂质正在那里出峰。换成 30 % → 90 %、10 分钟的梯度，每个峰都在 k ≈ 1 附近流出；再把粒径换成 1.7 µm 看看柱压。最后切回 GC，给正构烷烃用程序升温。

从峰面积到浓度：内标法

峰面积与进入检测器的物质的量成正比，但比例系数因化合物而异（FID 对乙醇的响应就比对 1-丙醇弱），而且每次进样的体积都有几个百分点的波动。内标法同时解决这两个问题：在每个样品和标准中加入等量的内标物——一种样品中没有、性质相近、峰位分得开的化合物。定量时用分析物与内标的面积比，进样多一点或少一点，两个峰同比例变化，比值不变。

先用已知浓度的标准求出响应因子 F，再由未知样的面积比求浓度。更可靠的做法是配几个浓度，作“面积比–浓度”校准线。

\frac{A_\mathrm{X}}{[\mathrm{X}]} = F\,\frac{A_\mathrm{S}}{[\mathrm{S}]}\qquad\Rightarrow\qquad [\mathrm{X}] = \frac{A_\mathrm{X}}{A_\mathrm{S}}\cdot\frac{[\mathrm{S}]}{F}

内标法的基本关系：F 由标准测定，[S] 是加入的内标浓度。

$A_\mathrm{X}, A_\mathrm{S}$: 分析物与内标的峰面积
$F$: 相对响应因子
$[\mathrm{S}]$: 样品中内标的浓度

PEG 柱 15 m · 70 °C · FID · 内标 1-丙醇

顶空气相色谱测血液乙醇：内标法

每个样品瓶：0.50 mL 血样（或校准品）+ 2.00 mL 1-丙醇内标溶液（0.100 g/L），密封后取顶空气体进样。

① 校准品（乙醇，mg/100 mL）

② 未知血样 #3

最近一次进样的色谱图

只看乙醇峰面积 · r² = 0.9980

面积比 A(乙醇)/A(丙醇) · r² = 1.0000

进样记录

样品	进样量（相对）	A(乙醇)	A(丙醇)	比值
校准 20	0.981	118	314	0.3763
校准 50	1.055	320	337	0.9498
校准 80	0.940	457	300	1.5229
校准 120	1.026	747	328	2.2776
校准 200	1.002	1213	319	3.8086

五个校准品已各进样一次。比较两张校准图：只用乙醇峰面积时点子因进样量波动而散开（r² 较低），用面积比时几乎落在一条直线上。然后对未知血样进样两次，读出浓度；多点几次同一个校准品，看原始面积跳多少、比值跳多少。

例题精解

用响应因子计算血液乙醇

校准品含乙醇 1.00 g/L，加入与样品相同的 1-丙醇内标（折合 0.400 g/L），测得 $A_\text{乙醇} = 3040$ ， $A_\text{丙醇} = 1596$ 。未知血样同样处理后 $A_\text{乙醇} = 2270$ ， $A_\text{丙醇} = 1612$ 。求血液中乙醇的浓度（mg/100 mL）。

概念检查

测定血液乙醇时，为什么常选 1-丙醇作内标？

因为它和乙醇在同一时间流出，便于比较血液中通常没有它，它的挥发性和顶空分配与乙醇相近，而且与乙醇完全分离因为 FID 对它和乙醇的响应因子正好都是 1 因为它不挥发，不会进入顶空

计算练习

恒温色谱中，正庚烷的调整保留时间为 2.00 min，正辛烷为 4.20 min，某未知物为 3.10 min。它的保留指数是多少？

要点回顾

GC 按挥发性和与固定液的作用分离；柱温升高 20–30 °C，k 约减半；保留指数把化合物定位在正构烷烃之间。
反相 HPLC 中 $\lg k = \lg k_\mathrm{w} - S\varphi$ ：有机溶剂比例越高，洗脱越快。
程序升温和梯度洗脱解决一般洗脱问题；改变固定相或流动相是改变选择性的主要手段。
内标法用面积比定量，抵消进样体积的波动；响应因子必须用标准测定。

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数据与参考文献

D. C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, 9th ed. (2016), Ch. 24 (gas chromatography), Ch. 25 (HPLC), Ch. 5 (internal standards).
W. O. McReynolds, “Characterization of some liquid phases”, J. Chromatogr. Sci. 8, 685–691 (1970); E. Kováts, Helv. Chim. Acta 41, 1915–1932 (1958).
L. R. Snyder, J. W. Dolan, High-Performance Gradient Elution (Wiley, 2007); L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd ed. (Wiley, 2010).
J. T. Scanlon, D. E. Willis, “Calculation of flame ionization detector relative response factors using the effective carbon number concept”, J. Chromatogr. Sci. 23, 333–340 (1985).
NIST Chemistry WebBook, SRD 69: Antoine parameters of the n-alkanes; gas-chromatographic retention indices.
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