第 2 课 · 25 分钟

色谱原理：保留、选择性与 Rf

把萃取重复成百上千次，就是色谱。分子在流动相与固定相之间来回分配，走得快慢由保留因子 k 决定；在薄层板上分离叶片色素，读出 Rf。

本课目标

说明色谱中固定相、流动相的作用，以及“分配—迁移”如何把混合物分开
由保留时间计算保留因子 $k$ 与选择性 $\alpha$ ，由薄层斑点计算 $R_\mathrm{f}$
预测展开剂极性对吸附色谱中 $R_\mathrm{f}$ 的影响，并选择合适的展开剂
列举主要的色谱类型及其分离依据

1906 年，俄国植物学家茨维特把叶片的石油醚提取液倒进一根装满碳酸钙粉末的玻璃管，再不断加入溶剂冲洗：绿色的提取液在管中展开成一条条黄、绿、橙色的色带。他把这种方法叫作 chromatography——“用颜色书写”。一百多年后，从兴奋剂检测、食品中农药残留到新冠疫苗的纯度，几乎所有复杂样品都要先经过色谱分离。颜色早已不是必需的，但原理一点没变。

先预测

两种溶质在“试管阵列”中逐管分配：溶质 1 的保留因子 k = 1（一半时间在流动相中），溶质 2 的 k = 3。流动相已经向前转移了 20 次，两条色带的中心大约在哪里？

先选一个答案并锁定，再看模型怎么说。猜错比不猜学得更多。

都在第 20 管溶质 1 在第 10 管，溶质 2 在第 5 管溶质 1 在第 20 管，溶质 2 在第 10 管溶质 1 在第 10 管，溶质 2 在第 15 管

两个相，一种竞争

色谱柱里有两个相：固定不动的固定相（硅胶、键合在硅胶上的 C18 长链、毛细管内壁上的聚合物液膜），和不断流过的流动相（气体或液体）。溶质分子在两相之间不停地进出，每一瞬间都遵守上一课的分配平衡。它们只在流动相中前进，所以在固定相里停留越久，走得越慢。

把“停留时间之比”写成一个数，就是保留因子 $k$ ：溶质在固定相中的量与在流动相中的量之比。完全不被保留的物质（如 GC 中的甲烷）随流动相一起流出，所用时间叫死时间 $t_\mathrm{M}$ ；溶质的保留时间 $t_\mathrm{R}$ 更长，多出来的部分 $t_\mathrm{R} - t_\mathrm{M}$ 正是它“躲”在固定相里的时间。两种物质能否分开，取决于它们的 k 之比——选择性 $\alpha$ 。

k = \frac{n_\mathrm{s}}{n_\mathrm{m}} = K\,\frac{V_\mathrm{s}}{V_\mathrm{m}} = \frac{t_\mathrm{R} - t_\mathrm{M}}{t_\mathrm{M}}\qquad t_\mathrm{R} = t_\mathrm{M}(1 + k)\qquad \alpha = \frac{k_2}{k_1}

保留因子把分配系数 K 与相比 V_s/V_m 结合起来；选择性 α > 1 是分离的前提。

$n_\mathrm{s}, n_\mathrm{m}$: 溶质在固定相、流动相中的物质的量
$K$: 分配系数 c_s/c_m
$t_\mathrm{M}$: 死时间：不保留物质的流出时间
$t_\mathrm{R}$: 保留时间
$\alpha$: 选择性（相对保留），取后流出者比先流出者

薄层色谱（TLC）把固定相铺成一薄层涂在玻璃或铝片上。样品点在起点线上，展开剂靠毛细作用向上爬，斑点跟着移动。斑点移动距离与溶剂前沿移动距离之比叫比移值 $R_\mathrm{f}$ 。在理想情况下，溶质只有 $1/(1 + k)$ 的时间在移动，所以 $R_\mathrm{f} = 1/(1 + k)$ ，也就是 $k = (1 - R_\mathrm{f})/R_\mathrm{f}$ 。

硅胶表面布满极性的 Si–OH，极性分子吸附得牢。展开剂中极性溶剂（这里是丙酮）越多，越能把吸附的分子“顶替”下来， $R_\mathrm{f}$ 越大。好的展开剂让目标斑点落在 $R_\mathrm{f}$ 0.2–0.8 之间：太低挤在原点，太高挤在前沿。

R_\mathrm{f} = \frac{d_\text{spot}}{d_\text{front}} = \frac{1}{1 + k}

薄层色谱的比移值。斑点距离从原点中心量到斑点中心。

$d_\text{spot}$: 斑点中心移动的距离
$d_\text{front}$: 溶剂前沿移动的距离

硅胶板 · 正己烷–丙酮展开剂 · Rf 由吸附模型计算

薄层色谱：分离叶片色素

展开剂中丙酮的体积分数 · 70 : 30

展开时间 0.0 / 12 min

1 叶片提取液
2 标样：叶绿素 a
3 标样：β-胡萝卜素

Rf 随展开剂组成的变化（计算）

β-胡萝卜素
叶绿素 a
叶绿素 b
叶黄素

提取液中的斑点

展开后再测量。

点“展开”看前沿爬升：它越爬越慢（z² ∝ t）。在 30 % 丙酮下测出四个斑点的 Rf，再把丙酮降到 10 %、升到 60 % 各做一块板：哪一种组成让相邻斑点的 Rs 都大于 1？用第 2、3 道的标样确认斑点身份。

例题精解

从色谱数据求 k 与 α

硅胶板上溶剂前沿移动了 6.0 cm，叶绿素 a 斑点移动 3.1 cm，叶绿素 b 斑点移动 2.6 cm。求两者的 $R_\mathrm{f}$ 、 $k$ 和选择性 $\alpha$ 。

按固定相与分离机理，色谱大致分为几类：

吸附色谱：硅胶、氧化铝表面的吸附（TLC、茨维特的色谱柱）；
分配色谱：溶质在液膜或键合相中“溶解”，如气相色谱的聚硅氧烷液膜、反相液相色谱的 C18 键合相；
离子交换色谱：带电的固定相吸引带相反电荷的离子，用于分离氨基酸和无机离子；
体积排阻色谱：多孔凝胶按分子大小筛分，大分子先出来，用于测高分子的分子量分布；
亲和色谱：固定相上接有能特异结合目标分子的抗体或配体，一步纯化蛋白质。

流动相是气体时叫气相色谱（GC），是液体时叫液相色谱（LC），后面两课会详细讨论。

概念检查

在硅胶板上把展开剂从正己烷–丙酮 9 : 1 改为 6 : 4，叶片色素斑点会怎样？

Rf 都变小，斑点更靠近原点 Rf 都变大，斑点向前沿靠拢 Rf 不变，只是展开更快顺序颠倒：极性色素跑到最前面

计算练习

某峰的保留时间为 7.50 min，未保留的标记物在 1.50 min 流出。该组分的保留因子 k 是多少？

要点回顾

溶质只在流动相中前进；保留因子 $k = (t_\mathrm{R} - t_\mathrm{M})/t_\mathrm{M}$ 衡量它在固定相中停留多久。
选择性 $\alpha = k_2/k_1 > 1$ 是分离的前提，它取决于两相的化学性质。
薄层色谱 $R_\mathrm{f} = 1/(1 + k)$ ；增大展开剂极性，硅胶上的 $R_\mathrm{f}$ 变大，理想范围 0.2–0.8。
谱带中心按 1/(1 + k) 的速度前进，宽度只按 √n 增长，所以走得越远分得越开。

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数据与参考文献

D. C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, 9th ed. (2016), Ch. 23 (introduction to analytical separations).
M. Tswett, “Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls”, Ber. Dtsch. Bot. Ges. 24, 384–393 (1906).
L. C. Craig, D. Craig, “Laboratory extraction and countercurrent distribution”, in Technique of Organic Chemistry, vol. III (Interscience, 1950).
E. Soczewiński, “Solvent composition effects in thin-layer chromatography systems of the type silica gel–electron donor solvent”, Anal. Chem. 41, 179–182 (1969).
H. T. Quach, R. L. Steeper, G. W. Griffin, “An improved method for the extraction and thin-layer chromatography of chlorophyll a and b from spinach”, J. Chem. Educ. 81, 385 (2004).